Importante ferramenta para auxiliar no diagnóstico clínico, a biologia molecular tem evoluído muito nos últimos anos. Com técnicas que se destacam pela rapidez e alta sensibilidade, ela tem sido de grande valia para detecção de agentes infecciosos.
Metodologias poderosas de sequenciamento de DNA têm auxiliado no diagnóstico de doenças genéticas, hematológicas, infecciosas e neoplásicas, ajudando também no estabelecimento de cura e tratamento eficaz.
Neste post, vamos desvendar um pouco sobre a área, descobrir o que é a biologia molecular e suas principais aplicações! Vamos lá?
O que é biologia molecular?
Área da biologia que estuda os organismos do ponto de vista molecular, focando principalmente no RNA e no DNA. A biologia molecular visa entender os fenômenos biológicos e como eles se relacionam com o material genético dos seres vivos.
Nascida da junção entre a genética, a bioquímica e a biologia celular, a biologia molecular tem como principal objetivo compreender e estudar os processos de replicação, transcrição e tradução do material genético. Além disso, estuda as regulações desses processos e seus possíveis erros e características.
Grande parte de seus conceitos e técnicas vieram a partir de estudos e experimentos realizados em bactérias, fungos e vírus. Por este motivo, a microbiologia também possui um papel fundamental no desenvolvimento da biologia molecular.
Mas ela nasceu devido aos avanços científicos que permitiram que o DNA fosse “visto” pela primeira vez. Em conjunto com o estudo de Mendel sobre hereditariedade, os cientistas viram a necessidade de estudar e entender melhor essa molécula complexa que carrega todas as informações relacionadas à hereditariedade.
Atualmente, as técnicas de biologia molecular estão cada dia mais sofisticadas e abrangentes, não só devido aos avanços tecnológicos dos equipamentos utilizados, quanto científicos relacionados a compreensão dos genes e suas funções.
Quais as aplicações da biologia molecular?
A biologia molecular e as suas técnicas têm contribuído para identificação de agentes infecciosos, mutações específicas que levam a proteínas com funções prejudicadas ou predisposição a doenças oncológicas, estabelecer prognóstico de doenças ou elencar o melhor tratamento a ser seguido especificamente para um paciente.
No geral, podemos dizer que as técnicas da biologia molecular focam na obtenção, identificação e caracterização do material genético quer seja de um paciente ou de um agente infeccioso que esteja lhe causando uma infecção ou doença.
Dentre elas, podemos destacar:
#1. PCR – Reação em cadeia da polimerase
Essa metodologia é amplamente utilizada para replicar um fragmento de material genético que desejamos estudar. Ou seja, com sua aplicação podemos obter milhares de cópias deste fragmento de interesse, possibilitando limitar-se a sua detecção, no caso da pesquisa de determinado agente infeccioso, por exemplo.
Essa pesquisa pode ser ampliada para sua quantificação e, em casos mais específicos, seguir para a técnica de sequenciamento para identificar variantes genéticas que causem refratariedade a determinado tratamento, como ocorre no caso da pesquisa do HIV.
Além disso, quando o foco da pesquisa são mutações em determinados genes do paciente, podemos simplesmente detecta-la em uma reação de PCR como depois caracterizá-la por meio do seu sequenciamento.
Esta técnica mimetiza o ciclo celular de divisão celular ou a transcrição da informação genética contida no DNA em seu produto, como em uma proteína, por exemplo.
Porém, de forma controlada e exponencial, podemos gerar milhares de cópias desta região de interesse utilizando uma enzima (DNA polimerase), a amostra de DNA é submetida a ciclos específicos de temperatura e combinado aos reagentes necessários, é possível realizar a sua cópia.
A eletroforese em gel ainda é utilizada após o PCR para verificar a presença de material genético estudado, onde o produto do PCR é aplicado em géis de agarose ou acrilamida em uma cuba e submetido a uma corrente elétrica, o material ao migrar pelo gel separa os fragmentos de DNA e RNA ou proteínas conforme seu peso molecular.
A utilização de um padrão conhecido (ladder) que corre em paralelo com as amostras, nos permite determinar os fragmentos de interesse pelo seu peso molecular.
1.1 PCR em tempo real
A PCR em tempo real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente.
O resultado é visualizado em tempo real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.
1.2 PCR digital
Já a PCR digital é a terceira geração das técnicas de PCR, que permite uma quantificação absoluta, altamente sensível de ácidos nucleicos sem a necessidade de curva padrão ou controles endógenos.
Em uma das estratégias do sistema de PCR Digital, a amostra é dividida em milhares de partículas (gotas) que após a amplificação, estas gotas contendo a sequência alvo são detectadas por fluorescência e classificadas como positivas e gotas sem fluorescência são negativas.
A PCR digital melhora a sensibilidade da qPCR e permite a detecção de eventos raros, tais como: mutações de um único nucleótido numa população de sequências de tipo selvagem além de ser útil na biópsia liquida, detecção de patógenos, expressão gênica e ainda análise de CNV (variação no número de cópias).
#2. Sequenciamento Sanger
Na técnica de sequenciamento, o material que foi amplificado previamente no PCR, é submetido a aparelhos que têm a capacidade de identificar, de forma sequencial, as bases nitrogenadas (“letras do DNA”) que compõem o fragmento em análise.
Isto permite identificar a alteração de uma única base que pode levar a uma mutação com consequente perda de função da proteína a ser codificada, o que por sua vez pode desencadear uma doença.
#3. Sequenciadores de nova geração (NGS)
Atualmente, existem técnicas que permitem o sequenciamento de DNA em larga escala, é o chamado sequenciamento NGS (Next Generation Sequencing).
Essa tecnologia permite a análise de múltiplos genes em uma única reação e é amplamente utilizada, hoje em dia, nos painéis genéticos, servindo para pesquisa de determinada doença e revelando suas características individuais, determinar o prognóstico e auxiliar no direcionamento da terapia mais efetiva.
#4. Southern Blot
Menos utilizada atualmente, devido ao uso de metodologias mais sensíveis e práticas, o Southern Blot permite identificar se determinada sequência de DNA está presente em uma amostra.
A técnica consiste, basicamente, em uma eletroforese em gel seguida de transferência para uma membrana, fixada por exposição térmica ou radiológica e revelada pelo uso de sondas com sequencia conhecida e marcadas com fluorófilos ou rádio isótopos.
#5. Northern Blot
Seu princípio é semelhante ao anterior, com a principal diferença de ser utilizada para identificação e a quantificação de RNA mensageiro, que é o responsável por enviar as informações do DNA até a síntese de proteínas nas células.
#6. Western Blot
Já no Western Blot, a análise e identificação é dirigida às proteínas, esse método mescla os princípios das técnicas Southern Blot e Northern Blot.
#7. Clonagem molecular
Utilizada, principalmente, em pesquisas e produção de imunobiológicos, esta técnica visa introduzir sequências específicas no DNA de uma célula e utilizar o mecanismo celular como base para a sua clonagem.
Primeiramente, é necessária a presença de um sítio de clonagem conhecido que, juntamente a uma enzima específica, permite fragmentar o DNA em regiões de interesse.
Utilizando a técnica de PCR, é possível replicar esses fragmentos obtidos inicialmente, obtendo-se, assim, grandes quantidades dele.
Os principais impactos no diagnóstico clínico
Com os avanços científicos e tecnológicos, as áreas de biologia molecular e genética tornaram-se ferramentas poderosas no laboratório clínico, suplementando as condições diagnósticas de diversas doenças.
Hoje, já é possível fazer previsões sobre o risco de desenvolvimento de doenças em indivíduos saudáveis, graças ao estabelecimento de associações de risco com polimorfismos genéticos presentes nas populações.
Nesse contexto, a biologia molecular assume uma crescente importância na área diagnóstica, destacando-se aplicações em algumas especialidades da medicina tais como: infectologia, saúde reprodutiva da mulher, genética de doenças raras, oncologia, medicina personalizada, identificação humana (vínculo genético) entre outras.
Um dos seus principais benefícios foi a descoberta da correlação entre a alteração do DNA e as características clínicas (fenótipo). Isso significa que uma mutação encontrada no DNA pode fechar o diagnóstico clínico ou caracterizar a susceptibilidade do paciente a determinada doença ou até mesmo ser considerada inofensiva.
São muitas as possibilidades que a biologia molecular trouxe e ainda pode trazer para auxiliar nos diagnósticos clínicos. Com o avanço tecnológico e a melhoria das técnicas, os estudos e trabalhos são promissores no que diz respeito à identificação de doenças e detecção de antígenos e anticorpos.
Você já conhecia a biologia molecular? Tem alguma dúvida sobre sua aplicação em diagnósticos clínicos? Deixe suas dúvidas nos comentários!